espectrometria de massas

Por Oscar Vega Bustillos*

A primeira conferência da Sociedade Brasileira de Espectrometria de Massas BrMASS foi realizada em novembro de 2005 na cidade de Campinas-SP.  A conferência teve como destaque o ilustríssimo palestrante Prêmio Nobel John Beneth Fenn.  No final da sua palestra, Fenn ressaltou que graças a sua pesquisa, a humanidade atingiu mais um passo para frente no entendimento da estrutura da matéria.  Nas suas palavras: “Nós aprendemos como fazer os elefantes voarem”, referindo-se ao descobrimento da técnica de ionização Electrospray.  Por meio desta técnica de ionização aplicada à espectrometria de massas, moléculas com massas molares acima de 1.000 Daltons (simbolicamente elefantes) são possíveis de serem ionizadas.  Este descobrimento abre a possibilidade de explorar com mais detalhes as macromoléculas biológicas. Certamente a conferência BrMASS-2005 foi inesquecível.

A espectrometria de massas com ionização por electrospray (ESI-MS) foi introduzida em 1984 por Masamichi Yamashita e John B. Fenn.  Anteriormente ao trabalho destes pesquisadores, em 1968, Malcolm Dole e colaboradores já haviam realizado trabalhos, que não foram suficientemente satisfatórios, com espécies poliméricas, sugerindo a aplicação desta técnica como um possível modo de ionização para espectrometria de massas.

Na ionização por electrospray (Figura 1) é formado um spray eletrostático da solução (analito) bombeada à um fluxo de alguns microlitros por minuto em um capilar metálico, sob um campo eletrostático, com uma tensão de 1 a 7 kV e cerca de 0,1mm de diâmetro interno.  O capilar está posicionado a cerca de 1 a 3 cm de um contra-eletrodo que conduz através de um orifício ao sistema de amostragem do espectrômetro de massas.  O alto campo elétrico na ponta do capilar gera um acúmulo de cargas na superfície do líquido por migração eletroforética, produzindo uma deformação na gota que recebe o nome de cone de Taylor.  À medida que o solvente evapora com o auxílio de gases nebulizante e secante (Turbo Heater), há um aumento da densidade de cargas da gota e, no momento em que esta densidade de cargas é capaz de vencer a tensão superficial do líquido, há um colapso e fissão da gota ascendente formando gotas menores descendentes.  As gotas descendentes sofrem o mesmo processo de dessolvatação da gota ascendente formando novas gotículas cada vez menores, com menor massa, porém, com maior densidade de cargas que as gotas ascendentes.

O processo de ionização por electrospray envolve três grandes etapas: 1) a produção da gota carregada na ponta do capilar, 2) a dessolvatação da gota carregada seguida de repetidas desintegrações para a formação de gotas menores e, 3) a formação dos íons na fase gasosa.

A intensidade do sinal de um analito no electrospray não depende exclusivamente da concentração deste analito em solução. Isto porque, a presença de outros eletrolitos no sistema é determinante na intensidade do sinal de um íon a ser detectado.  A faixa linear do electrospray, onde a concentração do analito é proporcional à intensidade do seu sinal, está localizada entre 10^-6 e 10^-3 mol L^-1.  A presença de eletrólitos interferentes na solução podem alterar esta seção linear, mas por outro lado, a determinação de concentrações do analito inferiores a 10^-5 mol L^-1 só é possível devido à presença de impurezas dos solventes que geralmente estão presentes nesta ordem de concentração.

A ionização por electrospay é uma técnica de ionização suave que é tipicamente utilizada para determinar os pesos moleculares de proteínas, péptidos e outras macromoléculas biológicas.  A ionização suave é uma técnica útil quando se considera moléculas biológicas de grande massa molecular, como a supracitada, porque esse processo não fragmenta as macromoléculas em partículas carregadas menores, mas transforma a macromolécula em pequenas gotículas.  Essas gotículas serão dessolvatadas em gotículas ainda menores, o que cria moléculas com cargas acopladas. Estes íons moleculares carregados e dessolvatados serão, então, guiados para o analisador de massas e detector, determinando a massa.

A Figura 2 apresenta análise de uma das moléculas biológicas mais importantes no ser humano, a hemoglobina.  A análise desta molécula nos laboratórios clínicos via Eletroforese envolvia procedimentos analíticos tediosos e demorados, exigindo dias para a conclusão.  No entanto, por ESI-MS a análise exige apenas horas de trabalho.  Os íons gerados no electrospray são geralmente protonados [M+H]⁺ formando clusters, dímeros ou íons adutos.

Existem algumas vantagens claras na utilização de espectrometria de massa de ionização por electrospray como um método analítico.  Uma delas é sua capacidade de lidar com amostras de grandes massas moleculares.  Ideal para ser acoplada com a Cromatografia Líquida (HPLC), gera íons à pressão atmosférica sem necessidade de vácuo.  Devido ser um modo de ionização branda, são formados íons sem fragmentação sendo ideal para acoplamento com espectrômetro de massas Tandem (Figura 1), onde no quadrupolo Q1, os íons precursores são selecionados, no Q2 denominada cela de colisão, os íons selecionados são fragmentados e no quadrupolo Q3, os íons produtos da fragmentação são monitorados.  A sensibilidade para este instrumento é impressionante e, portanto, pode ser útil em medições quantitativas e qualitativas precisas.

Algumas desvantagens da espectrometria de massa por ionização por electrospray também estão presentes.  Uma grande desvantagem é que essa técnica não pode analisar misturas, pois existe baixa confiabilidade nos resultados.  A limpeza da fonte de ionização não é simples, podendo se tornar excessivamente contaminada com resíduos de análises anteriores.  Finalmente, as múltiplas cargas associadas aos íons moleculares podem gerar dados espectrais confusos. Esta confusão é ainda alimentada pela utilização de uma amostra mista, o que é mais uma razão pela qual as misturas devem ser evitadas quando se utiliza um espectrómetro de massa por ionização por electrospray.

Figura 1. Diagrama esquemático da fonte de íons eletrospray acoplado a um espectrômetro de massas Tandem (ESI-MS/MS) (Fonte: Ho, C.S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry.)

Figura 2: Espectros de massas da hemoglobina. O espectro superior apresenta os dados dos íons de cluster das globinas α e β obtido via ESI-MS. O espectro inferior é o espectro após a deconvolução na escala de massa verdadeira após a transformação via software.

Referências bibliográficas

• Ho, C.S. Electrospray ionization mass spectrometry. Clin. Biochem. Rev. 2003. Feb. 24(1): 3-12.
• Bruins, A. Mechanistic aspects of electrospray ionization. Chromatogr. A., 794 (1998) 345-357.
• Martins H.A. Estudo de determinação de resíduos de glifosato e AMPA em amostras de soja e água via LC-ESI/MS/MS. Dissertação IPEN 2005.

*Oscar Vega Bustillos

Pesquisador do Centro de Química e Meio Ambiente CQMA do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares IPEN/CNEN-SP

55 11 3133 9343

ovega@ipen.br

www.vegascience.blogspot.com.br

Por Oscar Vega Bustillos*

Átomos e moléculas no estado gasoso são de difícil manipulação no laboratório, somente suas pressões podem ser variadas.  Uma vez que estes átomos e moléculas são ionizados, os íons produzidos podem facilmente ser controlados por campos eletromagnéticos.  A espectrometria de massas analisa a relação massa/carga destes átomos e moléculas por meio da manipulação de trajetórias iônicas dentro de campos eletromagnéticos.

O compartimento físico onde é realizada a ionização das moléculas neutras do analito a ser estudado por espectrometria de massas é conhecido como “Fonte de íons”, que também qualifica o instrumento para sua finalidade analítica.

Uma das técnicas para ionizar átomos e moléculas na espectrometria de massas pode ser por impacto de elétrons ou EI (Electron Ionization).  A mesma requer que a fonte de íons esteja em alto vácuo para não ter interferência com as moléculas da atmosfera do laboratório.  Nesta técnica, elétrons liberados por um filamento aquecido, colidem com moléculas gasosas que entram na fonte de íons.  O produto da colisão elétron-molécula é um íon positivo ou negativo num estado eletrônico vibracional excitado.

Os íons foram descobertos por Michel Faraday em 1830, quando trabalhava com células eletroquímicas.  Ele verificou que um grupo de moléculas, carregadas negativamente, viajava em direção ao anodo da célula e outro grupo de moléculas, carregadas positivamente, viajava em direção ao catodo.  Estas moléculas carregadas, positivamente ou negativamente, Faraday deu o nome de “íons”, que em grego significa “viajantes”.

Curiosamente, quem descreveu o mecanismo dos íons foi o químico sueco Svante Arrehenius na sua tese de doutorado em 1884.  Ele estudou as propriedades condutoras das dissoluções eletrolíticas; sua tese foi muito criticada pela banca examinadora e foi aprovada com a menor nota na Universidade de Uppsala.  Em 1903 a mesma tese ganhou o Premio Nobel de química em reconhecimento aos extraordinários serviços prestados no avanço da química por meio de sua teoria da dissociação eletrolítica.

Assim, o íon positivo é todo átomo ou molécula que perdeu um ou mais elétrons da sua camada eletrônica externa e o íon negativo é todo átomo ou molécula que ganhou um ou mais elétrons na sua camada eletrônica.

O canadense-americano Arthur Dempster, em sua tese publicada em 1916, utilizou pela primeira vez a técnica de ionização por impacto de elétrons.  Dempster explica como acontece este fenômeno: Quando uma corrente elétrica é aplicada a um filamento, o mesmo será aquecido pelo efeito Joule até a incandescência, emitindo elétrons como mostra a Fig.1A.  Um potencial de aproximadamente 70 V é mantido entre o filamento e a placa colimadora de tal forma que os elétrons sejam acelerados com uma energia média de 70 eV.  Estes elétrons interagem com as moléculas neutras do analito tornando-as íons positivos e negativos.  Na fonte de íons são instalados dois imãs permanentes criando um caminho helicoidal dos elétrons energizados, aumentando a probabilidade de interação com as moléculas neutras, acrescendo assim o número de íons na fonte (Fig.1B).

O valor de 70 eV é comum, porque a probabilidade de ionização, para muitos compostos, é maximizada próximo deste valor, como pode ser visto na Fig. 2A.  A produção de íons diminui para valores maiores de 70 eV devido às reações íon-molécula no interior da fonte de íons.

Como exemplo, a ionização do gás nitrogênio (N₂) por impacto do elétron primário, e_p^–, faz com que a molécula, em seu estado fundamental, seja elevada a energias maiores e escapando do poço de potencial da molécula neutra.  Um elétron secundário e_s^–, é também liberado pela molécula de nitrogênio, tal como é descrito na seguinte equação.

O impacto do elétron primário pode também aumentar a energia vibracional do cátion resultante, que tem uma função importante na espectrometria de massas.  Na medida em que a razão de vibração e o alongamento da ligação aumentam, a probabilidade de rompimento da ligação também aumenta.  A ruptura da ligação resulta na fragmentação do íon precursor, como se fosse uma taça de cristal que se quebra ao cair no chão.  Na investigação de moléculas gasosas por espectrometria de massas, observa-se frequentemente que a magnitude dos fragmentos detectados é muito maior que a do íon precursor, conhecido como íon molécula.  O padrão de fragmentação depende da composição do íon precursor e o exame do padrão de fragmentação leva a uma compreensão da estrutura e composição do íon precursor.  Para o nitrogênio a única fragmentação possível é o íon N⁺.  Neste ponto, a ionização por EI do analito nitrogênio esta completa e os íons N₂⁺, N⁺ e a contribuição isotópica ¹⁵N¹⁴N⁺ devem ser agora direcionados para o espectrômetro de massas onde serão discriminados segundo a razão m/z (Fig.2B).

Na fonte de ionização por impacto de elétrons produz 70% de íons positivos e o restante de íons negativos.  Isso ocorre porque existe uma probabilidade maior de arrancar elétrons das moléculas neutras.  Um pequeno percentual, menor que 0,01%, dos íons positivos produzidos na fonte, são transferidos para dentro do analisador do espectrômetro de massas quadrupolar (Fig.2B).

A ionização por EI geralmente é utilizada em interfases, como a da cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas GC/MS, ou na ionização de sondas com amostra sólida.  As amostras podem ser sólidas, liquidas ou gasosas, a única condição, que sejam voláteis.  Esta técnica de ionização é considerada uma ionização “forte” já que produz, além do íon molécula ou íon precursor, vários fragmentos iônicos conhecidos como íons produtos, que descrevem fielmente a estrutura molecular do analito em estudo.

O espectro de massas, gerado pela ionização por impacto de elétrons das moléculas em estudo, é reprodutivo, equivalente à impressão digital molecular, condicionado somente pela energia dos elétrons de ionização de 70 eV.  Graças a este fenômeno, no ano de 1969, foi gerado um banco de dados de espectros de massas da maioria das moléculas químicas voláteis pela agencia americana NIST (National Institute of Standards and Technology).  A maioria dos analisadores de GC/MS é comercializada com um banco de dados da NIST.

As vantagens da ionização EI são: Análise reprodutiva.  Alta eficiência de ionização.  A ionização não é seletiva.  Elevada fragmentação da molécula descrevendo a estrutura molecular do analito.  Interfaceamento com o cromatógrafo a gás (GC).  Banco de dados de espectros de massas que facilita a identificação e estrutura do analito.

As desvantagens da ionização EI são: A amostra tem que ser volátil.  A ionização cria alta energia interna na molécula do analito.  Não pode ser interfaceada com a cromatografia líquida (LC).  Os rearranjos iônicos dificultam a interpretação do espectro de massas.  A análise é limitada para analitos com massas moleculares inferiores a 600 Daltons.  Elevado fracionamento molecular complica a leitura do espectro de massas.  É imprescindível um sistema de alto vácuo para geração de íons.

Figura 1 A: Um filamento emissor de elétrons com energia 70 eV.

Figura 1 B Fonte de íons por impacto de elétrons gerando íons positivos e negativos. Em destaque os imãs permanentes utilizados para produzir maior número de íons.

Figura 2 A Energia de elétrons requerida para ionização de gases. Note que para a maioria dos gases, elétrons com energias de 70 eV produzem um número máximo de moléculas gasosas ionizadas.

B) Espectro de massas do gás nitrogênio gerado via ionização de elétrons, apresentam os íons N+ (m/z=14), N2+ (m/z=28) e a contribuição isotópica 15N14N+ (m/z=29).

Referências bibliográficas

• Stenhagen, E., Abrahamsson, S. e McLafferty, F.W. Atlas mass spectral data. Vol. 1, 2 e 3. John Wiley and Sons. New York. 1969.
• Bustillos, O.V., Sassine, A., March, R. A espectrometria de massas quadrupolar. 1ª. Edição. Scortecci editora, São Paulo. 2003.

*Oscar Vega Bustillos

Pesquisador do Centro de Química e Meio Ambiente CQMA do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares IPEN/CNEN-SP

55 11 3133 9343

ovega@ipen.br

www.vegascience.blogspot.com.br

Por Oscar Vega Bustillos*

A técnica de ionização química (CI Chemical Ionization), introduzida por Burnaby Munson e Frank H. Field em 1966, é uma consequência direta dos estudos fundamentais da interação íon/molécula.  A espectrometria de massas por ionização química (CI-MS) tornou-se uma ferramenta poderosa e versátil para a identificação e quantificação de moléculas orgânicas.  Possui uma ampla aplicação em muitos ramos da química, bioquímica e ambiental.

Este método de criação de íons é normalmente denominado de ionização “suave” quando comparada à ionização por impacto de elétrons (EI electron ionization).  A ionização química produz íons da amostra neutra sem depositar considerável quantidade de energia nos íons formados, em torno de 1 a 4 eV. Em contra partida a energia interna responsável pela extensiva fragmentação dos íons criados na ionização por impacto de elétrons é de 70 eV.  Isto é uma técnica de ionização “forte”.  Embora os padrões de fragmentação sejam de considerável utilidade analítica, o íon molecular é de extrema importância.   Muitos espectros de EI não contêm mais do que um traço do íon molecular ou até ficam ausentes.  Em contrapartida, os espectros de CI fornecem, em muitos casos, um intenso íon molecular e um padrão de fragmentação muito mais simples.

Na Figura 1 é apresentada a comparação dos espectros de massas obtidos via EI e CI da molécula Metionina C₅H₁₁NO₂S cuja massa molecular é  149 g mol^-1.  No espectro de EI o íon molécula (m/z 149) está presente com intensidade relativa iônica menor que 10%.  Pelo contrario no espectro de CI o íon molécula protonado [M+H]⁺ está com intensidade relativa iônica de 100% e com pouca fragmentação comparada com o espectro EI.  Na figura 1a é apresentada a molécula Metionina e suas massas fragmentadas obtidas com um software muito útil para o espectrometrista chamada ChemOffice.

Na prática a ionização química acontece em dois passos diferentes.  No primeiro um gás reagente (metano, isobutano ou amônia) é introduzido na fonte de íons mantida à vácuo (10^-5 mbar) e ionizado por meio de impacto de elétrons com 70 eV de energia, formando íons do gás reagente.  No segundo passo, as moléculas da amostra a serem analisadas são introduzidas na mesma fonte de íons, mas sem impacto de elétrons e com pressão superior à anterior (10^-3 mbar), onde acontece a ionização química pela interação com os íons do gás reagente.  Na ionização química de íons positivos, uma das reações mais utilizadas, tem sido a transferência de prótons dos íons reagentes (BH⁺) para a molécula da amostra M (Ver reação 1), onde ΔH corresponde a diferença de protoafinidade de B menos a protoafinidade de M.  Para que tal reação ocorra, a mesma deve ser exotérmica (ΔH negativo).  Isto implica que a protoafinidade do íon reagente (BH⁺) deve ser menor que a protoafinidade da molécula de interesse M.

BH⁺  +  M  →  [M+H]⁺  +  B      (ΔH)                                  (1)

A magnitude de ΔH e, em consequência, a extensão da fragmentação de MH⁺ pode ser controlada pela escolha correta do gás reagente.  Conceitualmente, a protoafinidade (P.A.) de uma molécula pode ser entendida como a quantidade de energia liberada quando da adição de um próton a esta.  Portanto, uma grande protoafinidade (P.A.) significa que mais energia é liberada quando da adição de um próton e, desta forma, a adição de um próton se torna energeticamente mais favorável.  Cabe salientar que as reações de transferência protônica são altamente eficientes, ocorrendo virtualmente em todas as colisões.  Caso a protoafinidade (P.A.) do íon reagente seja maior do que a da molécula de interesse, sua eficiência cairá e tornar-se-á muito baixa para reações endotérmica ou endoenergéticas.  Portanto, o principal parâmetro na CI reside na escolha correta do gás reagente cuja protoafinidade deve ser previamente conhecida (Ver equação 2).  A CI é muito utilizada nos analisadores GC/MS já que a fonte de íons é acoplada a injetores de gases reagentes.

P.A. (gás reagente) < P.A. (analito)                       (2)

A ionização química é tão seletiva que pode ser realizada numa fonte de íons com pressão atmosférica sem que as moléculas da atmosfera (nitrogênio, oxigênio e umidade) interferem na ionização.  Este foi uma experiência única onde uma agulha de tesla (corona) gera elétrons que ioniza a umidade atmosférica gerando os íons de hidrônio H₃O⁺ sendo estes íons doadores protônicos para as moléculas dos analitos de interesse, especialmente os hidrocarbonetos mais conhecidos na química da atmosfera como Compostos Orgânicos Voláteis (COVs).  O espectrômetro de massas que realiza estas análises é denominado como PTR-MS (Proton Transfer Reaction Mass Spectrometry).

A ionização química a pressão atmosférica APCI-MS (Atmospher Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry) é muito utilizado nas análises químicas de macro moléculas, além de ser a primeira seção do espectrometro de massas a ser liberada da dependência de um sistema de vácuo (Figura 2).  Certamente, com este desenvolvimento foram dados prêmios Nobel para os autores de este feitio.  Provavelmente, o cientista que deseja ganhar um prêmio Nobel terá que desenvolver um analisador e um detector do espectrômetro de massas, que não dependam do vácuo.

As vantagens da ionização CI são: Identifica o íon molécula protonado com alta intensidade.  Análise reprodutiva.  Baixa fragmentação da molécula do analito.  Interfaceamento com o cromatógrafo a gás (GC).  Não é imprescindível um sistema de alto vácuo para geração de íons protonados.  Gera íons a pressão atmosférica.

As desvantagens da ionização CI são: Não há uma libraria de espectros de massas. A amostra tem que ser volátil.  Depende da protoafinidade do gás reagente.

Figura 1: Espectros de massas da Metionina C5H11NO2S (M.W. 149). a) Obtida por Ionização por Elétrons (EI) com energia de 70 eV, observa-se o íon molécula M+. (m/z 149) com baixa intensidade. b) Obtida por Ionização Química (CI) usando Metano como gás reagente, observa-se o íon molécula protonado [M+H]+ (m/z 150) com elevada intensidade, além de menor fragmentação iônica (Fonte: Gross, J.H. Mass Spectrometry)

Figura 2. Diagrama esquemático da fonte de íons APCI-MS (Fonte: Bustillos, O.V.)

Referências bibliográficas

• Gross, J.H. Mass Spectrometry. A Tex Springer. Berlin. 2004.
• Harrison, A.G. Chemical Ionization Mass Spectrometry. CRC Press. Toronto. 1992.
• Bustillos, O.V. Procedimento analítico aplicado ao estudo de gases provenientes da combustão de metanol por automóvel. Tese IPEN. 2003.

*Oscar Vega Bustillos

Pesquisador do Centro de Química e Meio Ambiente CQMA do Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares IPEN/CNEN-SP

55 11 3133 9343

ovega@ipen.br

www.vegascience.blogspot.com.br