O pico ficou menor. A primeira suspeita recai sobre a extração. Mas há outra possibilidade. O analito pode ter chegado à fonte de ionização e produzido menos sinal por causa dos compostos que chegaram com ele.
Esse é um dos desafios do efeito de matriz em LC-MS/MS. A resposta depende da quantidade de analito introduzida e das condições em que seus íons são formados e detectados. Componentes coeluentes podem suprimir ou aumentar essa resposta, comprometendo a quantificação quando o método não controla adequadamente o fenômeno.
O trabalho de Matuszewski, Constanzer e Chavez-Eng, publicado em 2003 na Analytical Chemistry, estabeleceu uma abordagem experimental para distinguir efeito de matriz e recuperação da extração. Essa distinção continua sendo fundamental para interpretar o desempenho de métodos baseados em cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas.[1]
O que acontece quando a matriz chega à fonte
Na ionização por electrospray, ESI, a solução é submetida a um processo que gera gotículas carregadas e permite a formação de íons em fase gasosa. A presença de outras espécies pode modificar esse processo.
Entre os mecanismos discutidos na literatura estão a competição por carga e alterações nas propriedades das gotículas. O resultado pode ser uma diminuição da resposta, chamada supressão de ionização, ou um aumento, conhecido como intensificação da ionização. A intensidade do efeito depende do composto e das condições analíticas.[4]
O problema também ocorre fora das matrizes biológicas. Em uma nota de aplicação com pesticidas em águas ambientais, a Agilent demonstrou diferenças associadas à matriz e avaliou sua redução por extração em fase sólida online. A comparação incluiu águas ultrapura, de abastecimento, subterrânea e de rio, mostrando por que soluções com a mesma concentração nominal podem apresentar respostas diferentes.[7]
A seletividade do MS/MS não elimina a supressão
Monitorar uma transição específica ajuda a distinguir o analito de possíveis interferentes. Entretanto, a seleção dos íons não impede que componentes da matriz alterem a ionização antes da análise de massas.
Assim, a ausência de um pico interferente evidente não comprova ausência de efeito de matriz. O cromatograma pode parecer satisfatório enquanto a resposta do analito está sendo modificada. Essa limitação integra a discussão experimental apresentada por Matuszewski e colaboradores sobre a seletividade de métodos baseados em HPLC-MS/MS.[1]
Um cromatograma visualmente limpo não demonstra, por si só, que a ionização permaneceu inalterada.
Três preparações para separar os fenômenos
Para distinguir efeito de matriz, recuperação da extração e eficiência global do processo, uma estratégia utiliza três conjuntos de preparações.
| Conjunto | Preparação | Função na comparação |
|---|---|---|
| A | Analito em solução sem matriz. | Estabelecer a resposta de referência. |
| B | Matriz branca processada e fortificada após a extração. | Avaliar a resposta na presença dos componentes que permaneceram no extrato. |
| C | Matriz branca fortificada antes da extração e submetida ao preparo completo. | Avaliar o efeito combinado do preparo e da matriz residual. |
As comparações precisam considerar quantidades equivalentes de analito, volumes finais, diluições e condições de injeção. A fortificação após a extração permite investigar a alteração da resposta sem submeter o analito às perdas das etapas anteriores ao ponto de adição.
Já a comparação entre fortificações antes e depois da extração permite estimar a recuperação das etapas compreendidas entre esses dois pontos do procedimento.[5,6]
Cada relação responde a uma pergunta
Como a matriz altera a resposta?
Fator de matriz = resposta B ÷ resposta A.
Um fator inferior a 1 indica supressão. Um fator superior a 1 indica intensificação. Um valor próximo de 1 sugere pequena alteração da resposta nas condições avaliadas.[5]
Quanto o preparo recupera?
Recuperação da extração (%) = resposta C ÷ resposta B × 100.
Essa comparação utiliza duas preparações com matriz residual, diferenciadas pelo momento de adição do analito.[6]
Qual é o efeito global do processo?
Eficiência global do processo (%) = resposta C ÷ resposta A × 100.
Essa relação combina o efeito das etapas de preparo com a influência da matriz na resposta. Portanto, não deve ser interpretada automaticamente como recuperação da extração.[5]
A nomenclatura também exige cuidado. Alguns trabalhos expressam o efeito de matriz em uma escala na qual 100% representa ausência de alteração. Outros utilizam 0% como referência. Registrar a equação empregada evita interpretações opostas para um mesmo valor.[5]
A infusão pós-coluna revela onde o sinal muda
A fortificação após a extração avalia o comportamento do analito nas condições de sua análise. A infusão pós-coluna acrescenta uma informação complementar, o perfil de alteração da resposta ao longo da corrida.
Uma solução do composto é introduzida continuamente após a coluna, geralmente por uma conexão em T, antes da fonte. Enquanto isso, o extrato da matriz percorre o sistema cromatográfico.
Comparando o sinal durante a injeção do extrato com uma corrida de referência sem matriz, é possível identificar regiões de supressão ou intensificação. Essas regiões podem ser confrontadas com o tempo de retenção do analito.[4]
González, Dubbelman e Hankemeier demonstraram aplicações dessa abordagem na avaliação do tratamento de amostras e na identificação de fontes inesperadas de efeito de matriz. O trabalho destaca sua utilidade para acompanhar o desempenho analítico além do desenvolvimento inicial.[3]
Um exemplo mostra por que a coeluição importa
Em uma nota de aplicação, pesquisadores da Waters investigaram o surfactante Triton X-100 em plasma e sua remoção por extração em fase sólida de modo misto.
No método estudado, os analitos não coeluíam com o Triton. A infusão pós-coluna permitiu, porém, observar o potencial de supressão durante a passagem do surfactante pela fonte. A remoção do composto reduziu esse efeito nas condições experimentais avaliadas.[6]
O exemplo evidencia uma distinção prática. A presença de um componente capaz de causar supressão precisa ser interpretada junto com seu comportamento cromatográfico e sua coincidência temporal com o analito.
O padrão interno ajuda, mas precisa ser adequado
O ICH M10 recomenda, sempre que possível, utilizar o analito marcado com isótopos estáveis como padrão interno em métodos com detecção por espectrometria de massas.
O documento também destaca cuidados com pureza isotópica, troca isotópica e presença de analito não marcado no padrão. A adequação precisa ser demonstrada durante a validação.[2]
Compensar a resposta e reduzir a interferência são objetivos distintos. A normalização pelo padrão interno não dispensa a avaliação experimental do comportamento do método em diferentes amostras.
Uma matriz não representa todas as amostras
A composição pode variar entre fontes e lotes. Por isso, demonstrar desempenho em um único extrato não caracteriza toda a variabilidade relevante.
O que o ICH M10 prevê no seu escopo bioanalítico
A avaliação do efeito de matriz prevê pelo menos três réplicas de controles em concentrações baixa e alta, preparados com matrizes de pelo menos seis fontes ou lotes diferentes.
Para cada fonte ou lote, a exatidão deve ficar dentro de ±15% da concentração nominal e o coeficiente de variação não deve exceder 15%. O documento contempla disposições específicas para matrizes raras.[2]
Esses critérios pertencem ao escopo do guia. Sua aplicação não deve ser automaticamente estendida a qualquer método ambiental, industrial ou de alimentos.
A intervenção depende do diagnóstico
Quando a investigação aponta efeito de matriz, as possibilidades incluem melhorar a limpeza do extrato, modificar a separação e avaliar a diluição. Cada escolha exige verificar o desempenho resultante.[5,7]
- Diluição. Pode diminuir a interferência, mas também reduz a concentração do analito e exige atenção à capacidade de quantificação.
- Limpeza do extrato. Uma etapa mais seletiva precisa reduzir componentes interferentes e preservar recuperação adequada.
- Separação cromatográfica. Alterações devem ser acompanhadas por uma nova avaliação da região em que o analito passa a eluir.
A pergunta que orienta a investigação é mais precisa do que simplesmente perguntar por que o pico caiu. É necessário estabelecer se houve perda durante o preparo, alteração da resposta na presença da matriz ou combinação dos dois fenômenos.
Em LC-MS/MS, compreender o sinal exige investigar tanto a quantidade de analito recuperada quanto o ambiente químico em que ela é medida.
Referências
- Matuszewski, B. K.; Constanzer, M. L.; Chavez-Eng, C. M. Strategies for the Assessment of Matrix Effect in Quantitative Bioanalytical Methods Based on HPLC-MS/MS. Analytical Chemistry, 75(13), 3019–3030, 2003.
DOI 10.1021/ac020361s. - ICH/FDA. M10 Bioanalytical Method Validation and Study Sample Analysis. Guidance for Industry, 2022.
Consultar documento oficial. - González, O.; Dubbelman, A.-C.; Hankemeier, T. Postcolumn Infusion as a Quality Control Tool for LC-MS-Based Analysis. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 33(6), 1077–1080, 2022.
DOI 10.1021/jasms.2c00022. - Zhu, P. et al. Development of an Untargeted LC-MS Metabolomics Method with Postcolumn Infusion for Matrix Effect Monitoring in Plasma and Feces. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 35(3), 590–602, 2024.
DOI 10.1021/jasms.3c00418. - Universidade de Tartu. Quantitative estimation of matrix effect, recovery and process efficiency. Material de ensino de validação de métodos por LC-MS.
Consultar material. - Danaceau, J. P.; Chambers, E. E.; Fountain, K. J. Removal of Triton X-100 from Plasma Samples Using Mixed-Mode Solid Phase Extraction (SPE). Waters, 2011.
Consultar nota de aplicação. - Schuhn, B. Reduction of Matrix Effects with the Agilent 1200 Infinity Series Online SPE Solution. Agilent Technologies, 2014.
Consultar nota de aplicação.