O Teste do Limulus (LAL) | Analytica 92
Por Claudio Kiyoshi Hirai*
O Teste do LAL é utilizado na determinação das endotoxinas bacterianas em produtos injetáveis. O princípio do teste baseia-se no processo de coagulação que ocorre com a hemolinfa do Limulus polyphemus na presença de lipopolissacarídeos.
O processo de coagulação da hemolinfa do Limulus ocorre por meio de uma série de reações em cadeia similares ao processo de coagulação do sangue em mamíferos. Os responsáveis pela coagulação da hemolinfa dos caranguejos Limulus polyphemus são os amebócitos, os principais componentes da hemolinfa deste animal. Os amebócitos cumprem nos invertebrados um papel semelhante ao dos glóbulos brancos dos vertebrados, defendendo o organismo de agentes patogénicos e libertando uma série de enzimas como resposta a endotoxinas provenientes das bactérias. Os investigadores estudaram este fenômeno até conseguirem comprovar que ao diluir um lisado dos amebócitos extraídos do caranguejo ferradura em meio aquoso, podem ser detectadas quantidades muito pequenas de endotoxinas.
As endotoxinas são complexos de alto peso molecular associadas à membrana externa de bactérias Gram negativas. São a maior fonte de pirogênio nos produtos injetáveis fabricados pela indústria farmacêutica.
Os amebócitos contêm enzimas pro-coagulantes que desencadeiam uma cascata de reações. O produto final destas reações em cadeia é um gel composto por proteínas coaguladas. A resposta enzimática é produzida ao contato dos amebócitos com as endotoxinas. Este mecanismo é comparado frequentemente como o da tripsina que também desencadeia uma cascata de reações para finalmente formar a trombina, responsável pela coagulação do sangue em humanos.
O teste do gel clot é comercializado desde a década de 1970, baseando-se na formação do gel. Volumes iguais do reagente e da solução a ser analisada são transferidos a tubos de ensaio. Esta mistura é incubada a 37ºC durante 1 hora. O ponto final da reação é verificado através da inversão dos tubos a 180º, sendo que a presença do gel que se mantém sólido durante a inversão é considerado positivo para a presença de endotoxinas.
A Farmacopéia Brasileira na sua 5ª edição descreve o método da formação do gel, turbidimétrico ou colorimétrico do tipo cinético. Sendo que o método de formação do gel deve ser validado de acordo com a recomendação farmacopéica.
MÉTODO DE COAGULAÇÃO EM GEL: baseado na formação de coágulo ou gel (método semi-quantitativo).
MÉTODOS FOTOMÉTRICOS quantitativos que incluem: O MÉTODO TURBIDIMÉTRICO, (baseado no desenvolvimento de turbidez após quebra de um substrato endógeno); O MÉTODO CROMOGÊNICO (baseado no desenvolvimento de cor após quebra de um complexo peptídeo sintético cromógeno).
O reagente LAL (lisado de amebócito de Limulus sp.) é preparado para as leituras turbidimétricas ou colorimétricas e estes procedimentos podem ser utilizados se cumprirem os requisitos dos métodos. Para sua calibração é necessária a elaboração de uma curva padrão obtendo-se a sua regressão linear, na qual se determina, por interpolação, a concentração de endotoxina da substância sob teste.
O procedimento inclui incubação da endotoxina padrão para obtenção de uma curva de calibração e das soluções controle com reagente LAL, por tempo pré-determinado e leitura espectrofotométrica no comprimento de onda adequado. No caso do procedimento do método turbidimétrico, a leitura é feita imediatamente após período final de incubação, e para o procedimento colorimétrico a reação enzimática é interrompida no final do tempo pré-determinado pela adição do reagente, antes das leituras. Para os procedimentos cinéticos turbidimétricos e colorimétricos os valores de absorvância medida durante o período da reação e valores de velocidades são determinados para aquelas leituras.
Alguns produtos injetáveis podem apresentar problemas nos ensaios de endotoxina, por exemplo drogas insolúveis em água (suspensões), medicamentos baseados em associações, medicamentos quimioterápicos, medicamentos com atividades similares a endotoxina, etc.
A validação deve demonstrar que as amostras não interferem no ensaio de LAL sendo que 2 fatores devem ser considerados; determinação da sensibilidade do LAL, e determinação da potencialização ou inibição do teste.
*Claudio Kiyoshi Hirai
Gerente Técnico Biolab
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