Manutenção de culturas de referência | Analytica 91
Por Claudio Kiyoshi Hirai*
De acordo com os guias internacionais, as culturas de referência são necessárias para a avaliação do desempenho dos meios de cultivo como padrões de identificação microbiana e para a validação dos métodos de ensaio.
A rastreabilidade é necessária no estabelecimento de desempenho dos meios de cultura, na validação dos métodos analíticos, nos doseamentos microbiológicos de antibióticos e na utilização nos ensaios de desafio microbiano de conservantes.
Com o objetivo de demonstrar a rastreabilidade, os laboratórios devem usar cepas de microrganismos de referência obtidos diretamente de uma coleção nacional ou internacional reconhecidos, como o Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS) ou a American Type Culture Collection (ATCC), entre outras entidades reconhecidas.
Alternativamente podem ser utilizadas culturas comerciais que o laboratório tenha comprovado ter propriedades equivalentes.
De acordo com a ISSO 11.133-1, as cepas de referência podem ser subcultivadas uma vez para fornecer estoques de referência. Verificações bioquímicas e de pureza devem ser feitas em paralelo, conforme necessário. Recomendamos guardar estoques de referência em alíquotas congeladas ou liofilizadas.
Culturas de trabalho, para uso em rotina, devem ser subculturas primárias do estoque de referência. Uma vez descongelados, os estoques de referência não devem ser recongelados e reutilizados.
Estoques de trabalho não devem ser subcultivados, a não ser que isto seja estabelecido por um método padrão ou que os laboratórios comprovem que não houve nenhuma mudança em qualquer propriedade pertinente.
Os estoques de trabalho não devem ser subcultivados em substituição a estoques de referência. Culturas comerciais somente podem ser utilizadas como culturas de trabalho.
As cepas de referência têm um número máximo de gerações as quais podem ser subcultivadas. São cinco passagens a partir da cepa de referência original. As cepas comerciais derivadas da ATCC vendidas no comércio informam no rótulo o número da geração – por exemplo, 3a geração, deduzimos que poderemos subcultivá-los mais duas vezes até atingir a quinta geração.
A tabela apresentada abaixo informa o tempo que as culturas bactérias podem manter a sua viabilidade:
Condição | Temperatura Cº | Tempo |
Placas de agar | 4 | 4 a 6 semanas |
Tubos de agar inclinado | 4 | 3 semanas até 1 ano |
Freezer | -20 | 1 a 3 anos |
Super freezer | -80 | 1 a 10 anos |
Tubos liofilizados | Menor igual a 4 | + de 15 anos |
As culturas estoque de trabalho podem ser repicados em placas de agar e armazenados a 4ºC para uso diário ou semanal. Estas placas devem ser embrulhadas com filme plástico ou parafilm e guardadas invertidas para minimizar a contaminação microbiana e manter a hidratação do meio de cultura
Os tubos de agar inclinados devem ser semeados e armazenados em geladeira com tampas herméticas como tampas de roscas.
Para a manutenção das cepas em prazos maiores deve-se obter uma densidade bacteriana de cerca de 107 células/ mL, preparar uma solução de glicerol estéril a 20 -25% e adicionar 1 mL da suspensão a 1 mL de glicerol, sendo que esta solução pode ser mantida em freezer a -20ºC ou superfreezer a -80ºC.
Para a liofilização das cepas, o meio de liofilização recomendado é o skim milk em concentrações variáveis de 10 a 20%.
Fonte:
Habilitação para laboratórios de Microbiologica Anvisa – séries Temáticas.
*Claudio Kiyoshi Hirai
Gerente Técnico Biolab
55 11 3573-2905
55 11 3573-6812
