Considerações sobre a validação dos testes de limites microbianos

Por Claudio Kiyoshi Hirai*

A medida do número de microrganismos dependem da capacidade de recuperação dos microrganismos viáveis na presença de excipientes, matérias primas e produtos que podem possuir atividade bacteriostática ou bactericida.

A atividade residual dos produtos com atividade antimicrobiana podem levar a inibição do crescimento microbiano nos meios de cultivo.  Esta atividade residual deve ser neutralizada sendo necessário demonstrar a adequação da neutralização para estes testes microbiológicos.  Esta demonstração da neutralização nos testes microbiológicos é conhecida como demonstração da adequação do método.

A Farmacopéia Americana descreveu pela primeira vez na edição XI o teste de bacteriostase e fungistase, que deve garantir que substâncias fungistáticas ou bacteriostáticas sejam neutralizadas impedindo que se verifiquem resultados falso negativos.

Além do teste de esterilidade, a harmonização dos testes de limites microbianos aumentou as expectativas de comprovação da demonstração de adequação ao método.

As condições específicas do teste necessitam ser padronizadas, incluindo-se tampão utilizado, água, condições de iluminação, temperatura, preparação dos microrganismos, condições de armazenamento dos microrganismos, para que o estudo da validação reproduza as condições normais do teste.

A qualidade microbiológica constitui um dos parâmetros essenciais para segurança, eficácia e aceitabilidade dos produtos farmacêuticos de uso oral. A evolução tecnológica no desenvolvimento e produção de medicamentos estabelecem critérios a serem seguidos na produção de medicamentos envolvendo desde às análises do produto até validações metodológicas. Estas validações devem seguir parâmetros definidos pelos compêndios oficiais.

Outro aspecto a ser considerado na qualidade dos medicamentos refere-se ao uso adequado de conservantes que visam manter o produto farmacêutico dentro dos padrões microbiológicos durante o período de produção e na fase de utilização pelo consumidor. Para tanto deve-se lançar mão de neutralizantes capazes de neutralizar estes produtos.  O protocolo de validação do teste de desafio de conservantes deve contemplar os parâmetros: precisão, exatidão, linearidade e robustez. Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Candida albicans ATCC 10231, Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 e Staphylococcus aureus ATCC 6538, devem ser utilizados como microrganismos teste e inoculados numa concentração de 10-30 UFC/placa ou 30- 300UFC/placa. O teste da eficácia do conservante foi realizado através da inoculação na amostra de concentrações microbianas conhecidas e avaliações periódicas (tempos 0,1,7,14 e 28 dias) da viabilidade dos microrganismos teste.

A validação dos métodos de análise de Contagem Microbiana e Pesquisa de microrganismos específicos visa demonstrar que a substância em análise não interfere na metodologia e deve comprovar que o método de neutralização quando empregado é efetivo em inibir as propriedades antimicrobianas do mesmo (eficácia do agente neutralizante) sem impactar na recuperação dos microrganismos viáveis (toxicidade do agente neutralizante

Recomendamos a utilização das seguintes cepas nas validações de contagem:

Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739),             Salmonella enterica ssp. enterica sorotipo typhimurium (ATCC 14028);  Bacillus subtilis (ATCC 6633);                Clostridium sporogenes (ATCC 19404 ou ATCC 11437);  Candida albicans (ATCC 10231);            Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404).

A validação dos métodos de análise de contagem microbiana e pesquisa de patógenos visa demonstrar que o produto não interfere na metodologia. Deve comprovar que o método de neutralização quando empregado é efetivo, inibindo as propriedades antimicrobianas do mesmo (eficácia do agente neutralizante) sem impactar na recuperação dos microrganismos viáveis (toxicidade do agente neutralizante).         As condições específicas do teste, incluindo diluentes utilizados, meios de cultura, tempo e temperatura de incubação, precisam ser padronizadas no estudo de validação e aplicadas integralmente nas análises de rotina.  A validação deve ser realizada através da avaliação em triplicata do produto. Pode ser utilizado o mesmo lote (3 vezes) ou diferentes lotes do mesmo produto (1 vez cada lote perfazendo a triplicata).         A validação com o mesmo lote de produto implica na utilização de diferentes lotes de meios de cultura e soluções e a execução do teste em 3 dias diferentes (1 lote para cada dia).

Vários conservantes, podem ser inativados quimicamente.  Os compêndios descrevem alguns dos neutralizantes mais comumente utilizados (por exemplo na Farmacopéia Americana USP 39, capítulo 1227).  Existem no mercado, vários meios de cultura que tem na sua formulação a presença destes inativantes o que facilita o trabalho do microbiologista. Podemos citar o caldo D/E Letheem e  outros .

Os antibióticos beta lactamicos podem ser inativados através de uma solução de penicilinase.


Referências bibliográficas

  • Farmacopéia Brasileira 5º edição
  • IVTnetwork.com/article/harmonized-microbial-limits-testing-vlidation-strategies

*Claudio Kiyoshi Hirai

Gerente Técnico Biolab

55 11 3573-2905

55 11 3573-6812

chirai@biolabfarma.com.br

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