PCR: saiba mais sobre a técnica e como melhorar seus resultados

Metodologia se popularizou como uma das principais técnicas de análise para diagnóstico de COVID-19

Reconhecida com o Prêmio Nobel de Química em 1994, a técnica de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) proporcionou avanços na pesquisa científica, principalmente em biologia molecular. A técnica trouxe benefícios que impulsionaram o sequenciamento genético para testes de paternidade e investigações forenses, expressão gênica em sistemas recombinantes, além do diagnóstico de doenças e testes de novos medicamentos.

Existem diferentes formas da aplicação de PCR, entre elas, três se destacam:

PCR Convencional

Consiste na replicação de sequências específicas de DNA utilizando equipamentos termocicladores. Para realizar a reação acrescentam-se às amostras de material genético sequências iniciadoras complementares (também conhecidas como primers), desoxirribonucleotídeos e DNA-polimerase termo resistente.

Através da variação cíclica de temperaturas realizada pelo termociclador ocorre a desnaturação das fitas complementares de DNA, o anelamento de primers com suas regiões específicas de cada fita e a replicação do fragmento pela enzima DNA-polimerase. Após realizar um determinado número de ciclos, obtém-se milhares de cópias da sequência gênica de interesse.

RT-PCR

Na Polimerase por Transcriptase Reversa (RT-PCR) as moléculas de RNA são convertidas em DNA complementar (cDNA) através da atividade da enzima transcriptase reversa. Em seguida, os cDNAs recém-sintetizados são amplificados através dos mesmos procedimentos descritos na PCR convencional.

Uma vez que a técnica de RT-PCR permite amplificar amostras de RNA, sua aplicação é muito utilizada para detecção de doenças genéticas, patógenos virais e bacterianos.

qPCR

A técnica de PCR quantitativa (qPCR) utiliza os princípios básicos da PCR com o diferencial que permite a quantificação do material amplificado em tempo real. Termocicladores especializados são capazes de fornecer condições ideias de temperatura para a amplificação, bem como de detectar os sinais emitidos por reagentes específicos à medida que o DNA é amplificado.

A grande vantagem dessa aplicação é a rapidez na obtenção dos resultados. Além disso, é amplamente utilizada em associação à RT-PCR (qRT-PCR ou RT-qPCR), principalmente na área diagnóstica.

Para melhores resultados

Como as técnicas de PCR demandam o uso de altas temperaturas, a realização dessas reações requer atenção especial na seleção dos materiais que são utilizados. Esses cuidados devem envolver desde a seleção dos reagentes (enzimas polimerases, primers e nucleotídeos), até consumíveis plásticos utilizados como tubos, placas, tampas e selos.

O uso de materiais impróprios pode interferir liberando inibidores ou contaminantes na reação. Por isso, é sempre importante utilizar materiais confeccionados em plástico homogêneo e com paredes finas para a melhor transferência térmica, com certificação de esterilidade e livres de contaminantes como DNases, RNases e materiais genéticos.

A Greiner Bio-One entrega ao mercado materiais que possibilitam um alto padrão de qualidade para biologia molecular com materiais livres de DNase, RNase, DNA humano, não pirogênicos e não citotóxicos. Você pode conferir mais em: www.gbo.com.br, ou entre em contato: info@br.gbo.com.

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Referências:

Zaha, A.; Ferreira, H. B.; Passaglia, L. M. P – Organizadores. Biologia molecular básica. 5ª ed. Artmed, 2014.

Alberts B.; Johnson A.; Lewis J.; Raff M.; Roberts K.; Walter P. Biologia molecular da célula. 5ª ed. Artmed, 2010.

Garibyan, L.; Avashia, N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR), Journal of Investigative Dermatology, 133(3): e6, 2013.

Bustin, S., Benes, V., Nolan, T., & Pfaffl, M. Quantitative real-time RT-PCR – a perspective, Journal of Molecular Endocrinology, 34(3), 597-601, 2005.