O que é Micoplasma?

Os micoplasmas são os menores organismos autorreplicantes atualmente conhecidos pela ciência. Comuns na natureza, eles são um grupo de bactérias simples caracterizadas pela falta de uma parede celular e de um pequeno genoma. Muitas espécies de Micoplasma são encontradas no trato respiratório de animais, onde foram associadas a doenças – por exemplo, a Mycoplasma pneumoniae é uma das principais causas de infecções respiratórias em humanos. Assim como as infecções clínicas, os micoplasmas são contaminantes frequentes das culturas de células de mamíferos por uma infinidade de razões. 

Eles são capazes de escapar das defesas celulares do hospedeiro para sobreviver dentro das células. 

• Seu pequeno tamanho significa que não podem ser observados à microscopia óptica e são capazes de passar por filtros antibacterianos
• Muitos antibióticos comuns usados para proteger contra contaminantes bacterianos durante a cultura de células são ineficazes devido à falta de parede celular na bactéria
• Nem a presença da bactéria contaminante ou as alterações morfológicas consequentes da célula podem ser facilmente identificadas visualmente usando microscópios de luz, tornando a contaminação difícil de detectar

Isso resultou nas espécies micoplasma como sendo uma fonte difundida de contaminação de cultura de células, e os micoplasmas são um grande problema para a indústria biofarmacêutica. 

Efeitos da contaminação por micoplasma

Devido à sua incapacidade de produzir várias moléculas essenciais para a vida, as espécies de micoplasma devem viver como parasitas dentro das células hospedeiras para se replicar. As bactérias são capazes de invadir células de mamíferos para obter acesso a precursores biossintéticos e outros nutrientes. Este processo pode alterar drasticamente o metabolismo da célula hospedeira. Além disso, células contaminadas podem apresentar alterações cromossômicas induzidas e variação na expressão gênica. Essas mudanças podem reduzir drasticamente o rendimento e comprometer a segurança dos produtos biofarmacêuticos.

Testagem para micoplasmas

Os regulamentos de segurança exigem a demonstração da ausência de níveis detectáveis de micoplasmas no produto por meio de testes obrigatórios. Terceirizar esse teste pode garantir que ele seja executado de acordo com as especificações estabelecidas pelos padrões regulatórios. Muitas das diretrizes descrevem o uso do método de ágar e caldo e o teste de cultura de células indicadoras in vitro como o padrão ouro atual. No entanto, várias autoridades, incluindo a Agência Europeia de Medicamentos (EMA) e a Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos (FDA), também permitem métodos baseados em tecnologias baseadas em ácido nucléico (baseados em NAT), como PCR, após validação apropriada do ensaio.

A Sartorius oferece uma variedade de testes para a detecção de micoplasmas e pode fornecer orientação aos clientes sobre qual teste é mais adequado para seu material de teste.

A qualificação de ensaios de detecção de micoplasma validados deve ser realizada na presença de material de teste antes do teste. Isso é para detectar qualquer inibição do crescimento de micoplasma causada pelo material de teste (micoplasmastase) e isso envolve aumentar o material de teste com níveis baixos de micoplasmas, como M. pneumoniae ou Mycoplasma orale, e demonstrar recuperação.

Método ágar e caldo

O método de cultura direta permite a detecção de uma grande variedade de espécies de Micoplasma. O material de teste é usado para inocular diretamente ágar e caldo projetado especificamente para apoiar o crescimento de micoplasmas. As placas de ágar são incubadas durante 14 dias. As culturas de caldo são cultivadas durante 21 dias, com subculturas tomadas para inocular mais placas de ágar. Essas placas são então observadas microscopicamente quanto à presença de colônias de Micoplasma. Controles positivos de duas espécies de micoplasma também são inoculados durante o teste. A espécie exata usada depende do tipo de amostra que está sendo testada.

Cultura de células indicadoras in vitro 

Para o método de cultura de células indicadoras indiretas, células Vero ou outra linha celular apropriada são inoculadas com o material de teste e incubadas por três dias. As células são posteriormente fixadas e coradas com corante de fluorescência que pode se ligar ao DNA, como a coloração Hoechst ou 4’6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). As células podem então ser observadas sob microscopia de fluorescência. Os contaminantes do Micoplasma são identificados por seu agrupamento extranuclear característico ou padrões de coloração filamentosos dentro das células. Através deste ensaio, espécies não cultiváveis que dependem de células de mamíferos para o crescimento podem ser detectadas.

A combinação das abordagens direta e indireta permite a identificação de uma ampla gama de espécies de micoplasma. O benefício desses métodos combinados é que, devido à presença de um período de incubação, os micoplasmas podem se replicar, aumentando a sensibilidade do ensaio. No entanto, este período de incubação também prolonga o período de teste, atrasando o tempo em que qualquer contaminação pode ser confirmada.

PCR rápido para micoplasma

Várias autoridades, incluindo a EMA e a FDA, aceitam testes alternativos baseados em NAT como um substituto para os métodos diretos e indiretos tradicionais de detecção de micoplasma. O benefício desses métodos é o tempo de teste rápido, permitindo uma tomada de decisão mais veloz e uma quarentena mais rápida do material contaminado durante a fabricação de biofármacos. Para que os ensaios sejam validados, eles devem primeiro ser comparáveis ou melhores do que os testes tradicionais e fornecer ampla detecção de espécies de micoplasma.

A Sartorius fornece um ensaio de PCR em tempo real totalmente validado e qualificado para a detecção de micoplasmas, que está em conformidade com a seção 2.6.7 da Farmacopeia Europeia. Para este ensaio, o ácido nucleico é extraído de quaisquer células de micoplasma presentes na amostra, tanto de organismos livres quanto de células hospedeiras. Após a extração e purificação, o DNA é submetido a PCR em tempo real para identificar e quantificar baixos níveis de sequências alvo específicas para Micoplasma. O material de teste enriquecido com Controle Positivo Discriminatório de Micoplasma também é executado no ensaio Sartorius Stedim BioOutsource. É usado para identificar qualquer inibição causada pela amostra na detecção de micoplasma.

Conclusão

O teste de micoplasmas é essencial para garantir a segurança e a eficiência da fabricação de biofármacos e a detecção e quarentena de material contaminado para evitar a disseminação do organismo dentro das instalações de produção. Podemos fornecer testes usando o método direto e indireto e um PCR em tempo real totalmente validado para teste rápido de material de teste. Os testes seguem as especificações estabelecidas por vários órgãos reguladores, incluindo a EMA e a FDA, fornecendo a documentação necessária para o lançamento de biofármacos no mercado.

Para mais informações:

Sartorius do Brasil

E-mail: latam.marcom@sartorius.com

*Texto original publicado no Blog Science Snippets da Sartorius. Disponível em Inglês na página: https://www.sartorius.com/en/knowledge/science-snippets/what-is-mycoplasma-693938